Momento de adición del glicerol sobre la calidad espermática en la criopreservación de semen canino / Timing of glycerol addition on sperm quality in cryopreservation of canine semen

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del momento de adición del glicerol durante el proceso de enfriamiento sobre la calidad espermática del semen canino. Se utilizaron 15 eyaculados de 4 perros adultos. Cada muestra de semen fue dividida en alícuotas para someterlas a tres métodos de adición de glicerol (T1: al inicio; T2: al inicio y final; T3: al final de la curva de enfriamiento). El semen se envasó en pajillas de 0.5 ml y se congeló en nitrógeno líquido. Se evaluó la motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana posdescongelamiento. No se encontró diferencia estadística entre los tres métodos de adición del glicerol, pudiéndose simplificar el proceso de criopreservación al añadir todo el glicerol al inicio de la curva de enfriamiento.

The objective of the study was to evaluate the timing of adding glycerol during the cooling process on sperm quality of canine semen. Fifteen ejaculates from 4 mature dogs were used. Each sample was divided in aliquots and three methods of adding glycerol were used (T1: at the beginning; T2; at the beginning and at the end; T3: at the end of the cooling process). Semen samples were packed in 0.5 ml straws and frozen in liquid nitrogen. The post-thawing progressive motility and the functional integrity of membrane were evaluated. None statistical difference was observed due to the three treatments, indicating that the process of cryopreservation can be simplified by adding all the glycerol at the beginning of the cooling curve.

Determinación del tiempo máximo para recuperar y criopreservar espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo en caninos post orquiectomía / Optimal time for recovery and cryopreservation of epididymal canine sperm after orchiectomy

El objetivo del estudio fue determinar el tiempo máximo para recuperar y criopreservar espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo de caninos post orquiectomía. Se obtuvo testículos de 20 caninos entre 1 y 8 años de edad. Los testículos se colocaron en cloruro de sodio al 0.9% y se almacenaron a 5 ºC durante 0, 24, 48 y 72 horas. Los espermatozoides fueron recuperados al cortar la cola del epidídimo en un dilutor en base a Tris-citrato-fructosa. Para el proceso de criopreservación, se añadió yema de huevo (20%) y glicerol (5%) a la muestra diluida (espermatozoides + dilutor). La nueva dilución fue envasada en pajillas de 0.5 ml y sometidas a una curva de enfriamiento para luego sercolocadas en nitrógeno líquido. Se evaluó motilidad total, motilidad progresiva e integridad funcional de membrana. Previo a la criopreservación, la motilidad total varió significativamente después de 24 y 72 horas de almacenamiento a 5 ºC (p<0.05). Sin embargo, la motilidad total encontrada después del proceso de criopreservación sólo varió después de 72 horas de almacenamiento a 5 ºC (p<0.05). Similar tendencia se observó para la motilidad progresiva. La integridad funcional de membrana plasmática, tanto antes como después del proceso de criopreservación, no sufrió cambios significativos entre los grupos. Los resultados demuestran que es posible recuperar y criopreservar espermatozoides epididimarios hasta después de 48 horas de la orquiectomía del animal.

The aim of the study was to determine the maximum time to recover and cryopreserve spermatozoa from the tail of canine epididymis post orchiectomy. The testes were obtained through orchiectomy from 20 dogs aged 1 to 8 years. The testis were placed in sodium chloride 0.9% and stored at 5 °C for 0, 24, 48 and 72 hours. Spermatozoa were recovered by cutting the tail of the epididymis in an extender based on Tris-citrate-fructose. For the cryopreservation process, egg yolk (20%) and glycerol (5%) was added to the diluted sample (sperm + dilutor).The new dilution was packaged in 0.5 ml straws, which were subjected to a cooling curve and then placed in liquid nitrogen. Total motility, progressive motility and functional integrity of the membrane were evaluated. Before cryopreservation process, total motility after 24 and 72 hours of storage at 5 ºC decreased (p<0.05). However, total motility found after cryopreservation process varied significantly only after 72 hours of storage at 5 ºC (p<0.05). Similar trend was observed for progressive motility. The functional integrity of membrane, both before and after the cryopreservation process, did not suffer significant changes between groups. The results showed that it is possible to collect and cryopreserve epididymal sperm until 48 hours of orchiectomy.

Efecto de dilutores en base a Tris, Tes y leche descremada en la criopreservación de espermatozoides obtenidos del epidídimo de alpaca / Effect of extenders based on tris, tes and skim milk on cryopreservation of epididymal alpaca sperm

El estudio tuvo por objetivo evaluar el efecto de tres dilutores (Tris, Tes y leche descremada) en la criopreservación de espermatozoides obtenidos del epidídimo de alpaca. Previamente se determinó el efecto del tiempo entre el beneficio/castración y la recuperación de los espermatozoides del epidídimo. Se utilizaron 24 testículos de alpacas para la obtención de los espermatozoides directamente del epidídimo en una solución fisiológica buferada (PBS). La recuperación de espermatozoides se realizó a las 0, 35, 48 y 72 horas (6 testículos por grupo) y se evaluó la motilidad, concentración espermática e integridad funcional de membrana. Los espermatozoides recuperados a partir de 35 horas post beneficio/castración no fueron aptos para ser congelados. Las muestras recuperadas a las 0 horas fueron diluidas con Tris, Tes y leche descremada, enfriadas desde 35 a 5°C en 90 minutos, envasadas en pajillas de 0.25 ml y congeladas en nitrógeno líquido. Se evaluó la motilidad, integridad funcional de membrana y vitalidad/integridad acrosomal en las muestras descongeladas. La motilidad fue de 14.0, 8.6 y 17.0% en los grupos Tris, Tes y leche descremada, respectivamente, donde el grupo leche descremada fue significativamente mejor que el grupo Tes (p<0.05). Los porcentajes de integridad funcional de membrana y vitalidad/integridad acrosomal fueron similares entre los tres grupos. Se concluye que los tres dilutores brindan efectos similares para la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca.

The objective of this study was to evaluate the effect of three semen extenders (skim milk, Tris, and Tes) on cryopreservation of epididymal alpaca sperm. Previously, the effect of timespan since slaughtering or castration to the recovery of epididymal sperm was evaluated. Twenty-four alpaca testicles were used to obtain sperm from the epididymis in a buffered saline solution (PBS). The recovery of spermatozoa was performed at 0, 35, 48, and 72 hours (6 testes per group) after slaughtering or castration. Sperm motility, concentration, and sperm membrane functional integrity were analyzed. Sperm recovered after 35 hours was not usable for cryopreservation. Sperm samples recovered at 0 hours were subjected to the process of freezing. Samples were diluted with skim milk, Tris, and Tes, cooled from 35 to 5 °C in 90 minutes, packed into 0.25 ml straws and frozen in liquid nitrogen. After thawing, straws were evaluated by motility, sperm membrane functional integrity and vitality/acrosome integrity. Motility was 17.0, 14.0, and 8.6% on skim milk, Tris and Tes groups respectively, where the skim milk group was significantly better than the Tes (p<0.05). Percentages of sperm membrane functional integrity and vitality/acrosomal integrity were similar among the three extenders. It was concluded that all three extenders provided similar effects for the cryopreservation of epididymal alpaca spermatozoa.

Refrigeración de semen canino utilizando glucosa, fructuosa, trehalosa o sacarosa para prolongar la supervivencia espermática / Refrigeration of canine semen using glucose, fructose, trehalose or sucrose to extend sperm survival

Se evaluó el efecto la glucosa, fructosa, trehalosa y sacarosa, como componentes del diluyente, sobre la viabilidad espermática en semen canino refrigerado a 5 °C. La fracción espermática de 16 eyaculados de perro fue distribuida en cinco alícuotas conteniendo un diluyente a base de Tris - ácido cítrico - yema de huevo, pero con un azúcar distinto, además del control sin azúcar. Los cinco tratamientos se evaluaron a las 24, 48, 72 y 96 horas de refrigeración en base a motilidad progresiva e integridad funcional de membrana mediante la prueba hipoosmótica (HOS). En todos los grupos, a excepción del grupo control, la motilidad espermática se mantuvo dentro de rangos aceptables durante el estudio (90% en el día 0 hasta cerca de 60% en el día 4). Sin embargo, la integridad de membrana se mantuvo ligeramente superior en los grupos con azúcar (87-90%) en comparación con el grupo control (83-85%). La glucosa y sacarosa mostraron mejores resultados de motilidad y HOS. Se concluye que no se genera un daño significativo sobre la membrana espermática durante la refrigeración a 5 °C del semen canino, y que la utilización de cualquiera de los azúcares como sustrato energético para los espermatozoides, en especial glucosa y sacarosa, es de gran importancia para el mantenimiento de niveles apropiados de motilidad espermática e integridad funcional de membrana.

The effect of glucose, fructose, trehalose, and sucrose, as components of the extender, was evaluated on canine sperm viability during refrigeration at 5 ºC. The spermatic fraction of 16 dog ejaculations were distributed in 5 aliquots containing an extender based on Tris – citric acid – egg yolk, but differing in the presence of one of the sugars, plus a control without sugar. The five treatments were evaluated after 24, 48, 72, and 96 hours of refrigeration in relation to progressive motility and functional integrity of the membrane by the hypoosmotic swelling test (HOS). All groups, with the exception of the control group, the sperm motility maintained within acceptable ranges during the study (90% on day 0 and 60% on day 4). The integrity of the membrane remained slightly superior in groups with sugar (87-90%) in comparison with the control group (83-85%). The glucose and sucrose showed the best results in motility and HOS. It is concluded that no significant damage occurred on the sperm membrane while keeping semen at 5 ºC, and that the use of any of the tested sugars as energy-giving substrate for the sperm cells (especially glucose and sucrose) is of great importance for the maintenance of appropriate levels of sperm motility and functional integrity of the membrane.

Tipo y frecuencia de agresividad canina a humanos en pacientes de una Clínica Veterinaria en Lima / Type and frequency of canine aggressiveness to humans in patients of a veterinary clinic in Lima

El presente trabajo tuvo por finalidad conocer el tipo y frecuencia de agresividad del perro hacia el humano, así como las situaciones o contexto que las producen. Se encuestó a 405 propietarios de pacientes caninos, sin alteraciones neurológicas aparentes, de la Clínica de Animales Menores de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima. Se determinó que el 27.2% de los perros mostraron algún tipo de agresividad, mayormente de tipo leve y media, siendo la de tipo dominante la más frecuente (50.0%). Se encontró una asociación entre los tipos de agresividad dominante, territorial y predatoria con el sexo del perro (p<0.05), así como entre la intensidad de la agresividad dominante con el sexo (p<0.05), donde los machos fueron más agresivos. La situación más frecuente donde se produce la agresividad dominante fue al acercarse o intentar tocar al perro mientras come o sostiene un objeto que considera de su propiedad (90.9%).

The purpose of this study was to determine the type and frequency of aggressiveness directed to the human, and to identify the situations in which they occur. A survey was conducted on 405 owners of patients of the Small Animal Clinic of the Faculty of Veterinary Medicine, San Marcos University. All animals were without apparent neurological alterations. Results indicated that 27.2% of dogs showed some sort of aggressiveness, mainly light and medium intensity; where the dominant type was the most frequent (50.0%). The dominant, territorial and predatory aggressiveness was statistically associated with sex of the animal (p<0.05), as well as the intensity of the dominant aggressiveness (p<0.05), where males were more aggressive. The most frequent situation where dominant aggressiveness was manifested occurred when getting closer or trying to touch the dog while was eating or holding an object the dog considered its property (90.9%).

Estimulación con gonadotropina coriónica equina (ECG) durante las fases luteal y no luteal sobre la respuesta ovárica y calidad embrionaria en llamas / Equine chorionic gonadotrophin (ECG) stimulation during the luteal and non-luteal phases on ovarian response and embryo quality in llamas

Se evaluó el efecto del tratamiento superovulatorio en las dos fases del ciclo ovárico sobre la respuesta folicular y la calidad embrionaria en 45 llamas hembras adultas. Se incluyeron en el estudio aquellos animales que a la ecografía presentaron un folículo preovulatorio >7 mm. Los animales se distribuyeron en tres grupos: T0 (no estimulado), T1 (tratamiento superovulatorio en fase no luteal) y T2 (tratamiento superovulatorio en fase luteal). Los animales de T1 y T2 recibieron 1 ml de LH (día 0) para sincronizar la onda folicular y 1000 UI de eCG (día 3) como tratamiento superovulatorio. Se utilizaron esponjas vaginales impregnadas con progesterona entre el día 3 y 7 para simular la fase luteal en el T2. La inducción de la ovulación se hizo mediante monta natural y aplicación de 1 ml de GnRH (día 8). La colección y evaluación de embriones se realizó 7 días post cópula (día 15) en T1 y T2. En el grupo T0 se realizó monta natural y aplicación de GnRH y 7 días después se realizó la colección de embriones. El número de folículos preovulatorios fue mayor en T1 (11.07 ± 7.53) y T2 (6.13 ± 7.11) con respecto a T0 (1.07 ± 0.26) (p<0.05). El número de cuerpos lúteos fue mayor en T1 (9.27 ± 3.37) con respecto a T0 (1.07 ± 0.26) y T2 (6.47 ± 4.29) (p<0.05). Asimismo, el número de embriones recuperados fue mayor en T1 (3.47 ± 4.26) con respecto a T0 (0.33 ± 0.48) y T2 (1.33 ± 2.53). Los resultados permiten concluir que la aplicación del tratamiento superovulatorio durante una fase no luteal permiten obtener una mejor respuesta ovárica y embrionaria en comparación con tratamientos superovulatorios aplicados en fase luteal.

The effect of superovulatory treatment during the two phases of the ovarian cycle on follicular growth and embryo quality was evaluated in 45 sexually adult llamas. Animals bearing a >7 mm follicle, observed by ultrasonography, were selected and allocated into 3 groups: T0 (non-stimulated), T1 (superovulatory treatment during the non luteal phase), and T2 (superovulatory treatment during the luteal phase). Animals in groups T1 and T2 received 1 ml of LH (day 0) for synchronization of the follicular wave and 1000 IU of Ecg (day 3) as superovulatory treatment. Vaginal sponges impregnated with progesterone were used on days 3 to 7 in T2 to simulate the luteal phase. The induction of the ovulation (day 8) was done through natural mating and the application of GnRH (1 ml). Embryo recovery was done 7 days after natural mating (day 15) on T1 and T2. Similarly, embryo recovery was done 7 days after natural mating and application of GnRH in T0. The number of preovulatory follicles was larger in T1 (11.07 ± 7.53) and T2 (6.13 ± 7.11) than in T0 (1.07 ± 0.26) (p<0.05). The number of corpora lutea was larger in T1 (9.27 ± 3.37) than in T0 (1.07 ± 0.26) and T2 (6.47 ± 4.29) (p<0.05). The number of recovered embryos was larger in T1 (3.47 ± 4.26) than in T0 (0.33 ± 0.48) and T2 (1.33 ± 2.53). The results showed that superovulatory treatment during the non luteal phase had a better response than superovulatory treatment during the luteal phase.

Criopreservación de semen ovino empleando tres dilutores y cuatro combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes / Ovine semen cryopreservation using three extenders and four combinations of permeant and non permeant agents

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de tres dilutores y cuatro combinaciones de dos agentes crioprotectores permeantes más dos no permeantes sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para esto, en una primera fase se evaluaron entre tres dilutores (A, B y C) y el más adecuado se usó en una segunda fase, donde se evaluaron las siguientes combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes: 1) Glicerol - Trehalosa, 2) Glicerol - Sacarosa, 3) Etilenglicol - Trehalosa y 4) Etilenglicol - Sacarosa. En el experimento 1, se encontró que el Dilutor A mantenía mejor la motilidad progresiva, viabilidad e integridad acrosomal post-descongelamiento en comparación con los dilutores B y C, por lo que el Dilutor A se empleó en el experimento 2. En este ensayo se encontró que la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, la termoresistencia y la integridad de membrana plasmática post-descongelamiento fue mejor en los grupos con glicerol-sacarosa y glicerol-trehalosa en comparación con los grupos con etilenglicol-sacarosa y etilenglicol-trehalosa. Esto demuestra que el glicerol es un mejor crioprotector permeante en comparacion con el etilenglicol; sin embargo, no hubo diferencia en el uso de sacarosa o trehalosa. Se concluye que un dilutor con las características del dilutor A, utilizando glicerol más trehalosa o sacarosa, constituye una buena alternativa para la criopreservación de semen ovino.

The objective of the study was to evaluate the effect of three extenders and four combinations of two permeant and two non permeant cryoprotectant agents on the quality of post thaw ram semen. In Experiment 1, three extender were evaluated (A, B, and C) in order to select the best for the next step. In Experiment 2, different combinations of cryoprotectant agents were evaluated as follow: 1) Glycerol–Trehalose, 2) Glycerol–Sucrose, 3) Ethylene glycol-Trehalose, and 4) Ethylene glycol–Sucrose. In experiment 1, motility, viability and acrosomal integrity in extender A were higher than in extender B and extender C, and therefore, extender A was used for experiment 2. In this assay, motility, viability and acrosomal integrity, thermoresistance, and plasmatic membrane integrity were higher in groups Glycerol-sucrose and Glycerol-trehalose in comparison with groups Ethilene glycol-sucrose and Ethilene glycol-trehalose. However, there were not significative differences between sucrose or trehalose. In conclusion, an extender with characteristics of extender A using glycerol plus trehalose or sucrose constitute a good alternative for cryopreservation of ram semen.

Efecto de dos antioxidantes (tempo y tempol) en la criopreservación de semen ovino empleando un dilutor en base a tris / Effect of two antioxidants (tempo and tempol) on ram semen cryopreservation using the tris extender

Se emplearon 32 muestras de semen procedentes de cuatro ovinos a fin de ser criopreservadas con la adición dos antioxidantes: Tempo (2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil) y Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil), en concentraciones de 0.5, 1.0 y 2.5 mM, para evaluar el efecto postdescongelamiento que pudieran tener sobre la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal y la capacitación espermática prematura. En cada concentración de los dos antioxidantes y del grupo control se utilizó un dilutor en base a Tris, realizándose ocho repeticiones, cada una con cuatro muestras de semen. Los resultados obtenidos demuestran que la adición de Tempo a una concentración de 0.5 mM mejora significativamente la calidad del semen criopreservado en comparación con el grupo control (p<0.05), incrementado los porcentajes de motilidad progresiva (79 vs. 67 por ciento), viabilidad e integridad acrosomal (70 vs. 58 por ciento) y reduciendo la capacitación espermática prematura (9 vs.15 por ciento). Por otro lado, la adición de Tempol disminuyó la calidad seminal postdescongelamiento en comparación con el control. En conclusión, la adición de Tempo 0.5 mM en un dilutor en base a Tris, al finalizar la fase de enfriamiento, podría constituir una estrategia para mejorar la calidad de semen ovino criopreservado.

Thirty-two semen samples from four rams were frozed using two antioxidants, Tempo (2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl) and Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl), each one in concentrations of 0.5, 1.0, and 2.5 mM, to evaluate the effects on post-thawing motility, viability, acrosomal integrity, and earlier sperm capacitation. Eight replications for each antioxidant concentration and control group, were done using four semen samples per replication. Semen samples were diluted on a Tris extender. Results showed that Tempo 0.5 mM improved frozen semen quality in comparison with control group (p<0.05), by increasing progresive motility (79 vs. 67 por ciento), viability and acrosomal integrity (70 vs. 58 por ciento), and decreasing earlier sperm capacitation (9 vs. 15 por ciento). On the other hand, Tempol decreased frozen semen quality. In conclusion, the use of Tempo 0.5 mM on a Tris extender, at the end of the cooling process, could be an alternative for improving the quality of frozed ram semen.